|
Применение аутогенных фибробластов в косметологии
(по материалам, опубликованым в журнале "Эстетическая
медицина", т.3, ?4, с.336-342, 2004)
РЕЗЮМЕ
Получены препараты аутогенных культур фибробластов
кожи для проведения коррекции возрастных изменений кожи лица и области
шеи. Пациентки в возрасте 40-60 лет наблюдались в течение 12 месяцев.
Отмечен стойкий положительный эффект, проявлявшийся в исчезновении
мелких и уменьшении крупных морщин, а также в общем улучшении состояния
кожи. Методом клонирования показано, что фибробласты, полученные
от взрослых людей, сохраняют высокую способность к пролиферации.
Делается вывод о перспективности применения культуры аутогенных
фибробластов в терапевтической косметологии.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что соединительная ткань играет большую роль не только
при развитии, но и при старении организма. Уже давно сформулировано
мнение о том, что возраст человека определяется возрастом его соединительной
ткани. Следовательно, замедление старения соединительной ткани -
одна из наиболее важных задач эстетической медицины.
Основные клеточные элементы соединительной ткани
- фибробласты. Это клетки мезенхимального 1 происхождения, круглой
или удлиненной веретенообразной формы с отростками и плоским овальным
ядром. В результате дифференцировки фибробласты превращаются в зрелые
клетки - фиброциты (Схема из монографии Серова и Шехтера, 1981 г.)
Тесная взаимосвязь между мезенхимальными стволовыми
клетками и фибробластами в культуре отмечена в работах А.Я. Фриденштейна
в середине 60-х годов прошлого столетия [1]. В его лаборатории впервые
была получена однородная культура плюрипотентных стромальных стволовых
клеток костного мозга, прикрепленных к подложке, которые сохраняли
высокую скорость размножения в недифференцированном состоянии при
многих пассажах. Работы А.Я. Фриденштейна показали, что мезенхимальные
стволовые клетки при пересеве с малой плотностью после прикрепления
к подложке формировали клоны фибробластоподобных клеток.
Фибробласты - основные клетки среднего соединительнотканного слоя
кожи, называемого дермой. Главная функция фибробластов дермы - участие
в метаболизме межклеточного вещества. Состояние и функция основных
внеклеточных компонентов соединительной ткани, коллагеновых, эластических
и ретикулярных волокон и межклеточного матрикса зависят от функциональной
активности фибробластов. Фибробласты кожи синтезируют и выделяют
в окружающую среду большое количество биологически активных веществ,
среди которых можно выделить различные факторы роста (EGF, FGF,
TGF, KGF), компоненты внеклеточного матрикса (ГАГ, ГК, хондроитин
сульфат) и ферменты. Этот процесс происходит непрерывно, и благодаря
этому, межклеточное вещество постоянно обновляется.
(1мезенхима - эмбриональная соединительная ткань
KGF - фактор роста кератиноцитов
EGF - фактор роста эпидермиса, регулирует миграцию и пролиферацию
эпидермальных клеток кожи.
FGF - фактор роста фибробластов, стимулирует рост всех типов клеток
и продукцию внеклеточного матрикса,
TGF - транформирующий фактор роста, участвует в образовании новых
кровеносных сосудов)
С возрастом уменьшается толщина дермы, снижается содержание
влаги, в результате кожа теряет упругость и эластичность. Вследствие
этого появляются морщины. Старение кожи на различных участках тела
протекает неравномерно. Особенно быстро стареют открытые участки
и кожа в местах естественных складок.
Старение кожи - это сложный процесс, многие аспекты которого до
конца не изучены. С возрастом количество фибробластов в коже уменьшается,
и они становятся менее активны. Существует мнение, что одной из
основных причин старения кожи являются снижение способности фибробластов
кожи к делению и снижение уровня синтетической активности. Следовательно,
если каким-либо образом стимулировать эти процессы, то можно улучшить
состояние кожи.
Для коррекции возрастных изменений кожи в настоящее время используются
самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и
препараты (токсин ботулизма, компоненты внеклеточного матрикса и
соединительной ткани и т.д.). Многие из этих методов направлены
на стимуляцию собственных клеток кожи, в частности, фибробластов.
Однако можно решить проблему и другим образом - увеличить количество
фибробластов в коже с помощью их пересадки в те участки кожи, где
это необходимо.
Прежде чем пересадки фибробластов стали реальностью, пришлось решить
много методических вопросов и вопросов безопасности подобных процедур
[2]. Значительный прогресс в этом направлении был достигнут, когда
научились культивировать, то есть поддерживать жизнеспособность
фибробластов вне организма (in vitro). В 1961 году L. Hayflick и
P.S.Moorhead [3] представили данные о том, что даже в оптимальных
условиях культивирования in vitro эмбриональные фибробласты человека
способны делиться только ограниченное число раз (50 +/-10). Последняя
фаза жизни клеток в культуре была определена как клеточное старение,
а сам феномен был назван "лимитом Хейфлика". В последующих
исследованиях наблюдения Хейфлика были успешно воспроизведены [2].
Показано, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный
кариотип, способны расти только в прикрепленном к поверхности культурального
флакона состоянии, обладают феноменом контактного торможения и имеют
ограниченную продолжительность жизни. Кроме того, они не онкогенны
и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости. Эти особенности
нормальных фибробластов были закреплены в виде методических указаний,
которым должны соответствовать все получаемые культуры фибробластов
[10].
При соблюдении этих требований появилась возможность использования
культивируемых вне организма фибробластов человека для производства
иммунобиологических медицинских препаратов, а затем и для терапевтических
целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении
протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом развития
клеточных технологий на основе стволовых клеток.
В настоящее время можно выделить два основных подхода
к лечению кожи с помощью препаратов, содержащих интактные живые
фибробласты:
1. создание методов и препаратов для лечения дефектов кожи раневого
и ожогового характера с помощью культур аллогенных эмбриональных
фибробластов;
2. использование собственных фибробластов человека для заместительной
клеточной терапии кожных покровов.
Считается, что наилучшие результаты клеточной терапии
получаются при использовании культур эмбриональных фибробластов,
которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с культурами
от взрослых доноров. Однако применение клеток, полученных из эмбрионов,
имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же
время накапливаются данные, свидетельствующие о том, что при старении,
несмотря на уменьшение общего числа, собственные фибробласты организма
сохраняют способность к делению [4].
Целью исследования явилась отработка метода коррекции возрастных
изменений кожи с помощью собственных (аутогенных) фибробластов кожи
пациента, культивированных in vitro.
Для того чтобы убедиться в "омолаживающем"
потенциале аутогенных фибробластов, необходимо было предварительно
получить культуры фибробластов кожи от эмбрионов и взрослых доноров
и сравнить их пролиферативные способности. (Фибробасты с низкой
пролиферативной активностью не годятся для использования в процедурах
по омоложению кожи.)
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Культивирование фибробластов
Клеточный материал для получения культуры аутогенных
фибробластов брали путем биопсии кожи пациента в области предплечья.
Эмбриональные фибробласты были получены из кожи 8-12-недельных человеческих
эмбрионов, как описано в работе [5].
Получение и культивирование фибробластов из биоптата проводили по
стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань
промывали физиологическим раствором, содержащим антибиотики, и обрабатывали
раствором, содержащем ЭДТА2, трипсин и коллагеназу. Затем клетки
первичной культуры центрифугировали, отмывали от ферментов, и ресуспендировали
в среде культивирования. При культивировании использовалась среда,
содержащая 90% питательной среды ДМЕМ3 и 10% эмбриональной телячьей
сыворотки (см. рис).
(2 этилендиаминтетраацетат натрия
3 модифицированная среда Дюльбекко)
2. Клонирование фибробластов
Клонирование фибробластов проводили, как описано в
работе [5]. Трипсинизацию проводили с помощью раствора Версена и
трипсина при 4С. По 2 мл взвеси клеток высевали на пластиковые чашки
Петри (диаметром 40 мм) и инкубировали в условиях насыщающей влажности
при 37о С с 3-5% СО2. Число колоний определяли на 14-18 сутки после
посева. Клетки фиксировали 10% раствором формалина и окрашивали
метиленовым синим. Эффективность клонирования определяли как отношение
числа колоний к числу посеянных клеток. За эффективность прикрепления
принимали отношение числа клеток, прикрепившихся через 12 ч после
посева, к числу посеянных. В качестве контроля использовали штаммы
фибробластов, полученные из кожи 8-12-недельных эмбрионов. Всего
изучено 9 штаммов фибробластов человека, 5 - были получены из эмбрионов,
4 - из кожи взрослых доноров.
Для эмбриональных штаммов эффективность клонирования, то есть способность
клеток образовывать колонии, состоящие из 16 и более клеток, колебалась
от 38 до 82%, для постнатальных штаммов - от 12 до 60%.
Сравнительный анализ полученных данных показал, что несмотря на
снижение эффективности клонирования у взрослых людей, она остается
на достаточно высоком уровне. Это согласуется и с результатами других
исследований. Так, Cristofalo с соавт. [4], подводя итог многолетним
исследованиям по взаимосвязи возраста донора и способности его клеток
к пролиферации, сделали однозначный вывод: продолжительность жизни
фибробластов в культуре не коррелирует с возрастом донора.
Таким образом, приведенные данные указывают на обоснованность применения
аутогенных фибробластов для коррекции возрастных изменений кожи.
3. Тестирование культур фибробластов и приготовление
препаратов для инъекций
Полученные от пациентов культуры клеток культивировали
для наработки количества клеток, достаточного для пересадки (5-6
пассажей в культуре). Во избежание передачи инфекций фибробласты
тестировались на отсутствие контаминации ВИЧ, гепатитов А, В и С,
ЦМВ, микоплазмы и хламидий. Тестирование проводилось при помощи
ПЦР и иммуноферментных методов. Отсутствие онкогенных потенций клеток
определяли на бестимусных мышах. Далее монослойные культуры клеток
суспендировали в стерильном физиологическом растворе для инъекций
до конечной концентрации 4-5х106 кл/мл. Готовые суспензии сохраняли
при 40 С. Препараты клеток использовали в течение 24 ч после получения
суспензии клеток и процедуры определения их жизнеспособности.
4. Оценки жизнеспособности клеток в готовых препаратах
Жизнеспособность клеток в суспензии определяли с
помощью высевания суспензии клеток культуры через различные сроки
инкубации готовых препаратов и подсчета количества прикрепившихся
колониеобразующих клеток (таблица 1).
Таблица 1. Процентное содержание жизнеспособных клеток
в различные сроки после приготовления препаратов
| Время хранения препарата при 4° С,
ч |
% жизнеспособных клеток |
| 24 |
90 |
| 48 |
50 |
| 72 |
< 10 |
5. Процедура введения клеток
Клетки вводили пациенту однократно методом приемом
"папулы" для крупных морщин, или обкалывания мелких морщин
и проблемных зон с помощью микроинъекций. Количество клеток в препаратах
варьировало в зависимости от процедуры. Объем введимого препарата
составлял в среднем 1-3 мл.
II. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТУРЫ АУТОГЕННЫХ
ФИБРОБЛАСТОВ
Препараты аутогенных фибробластов вводились 70 пациенткам
в возрасте 40-60 лет с признаками естественного увядания кожи лица
и шеи. В анамнезе пациенток не было указаний на аутоиммунные заболевания
соединительной ткани (системная красная волчанка, ревматоидный артрит,
псориаз и т.д.). Количество вводимых клеток составляло в среднем
от 1х106 до 1х107. В первые часы после введения клеток наблюдали
местные эффекты в виде гиперемии и небольшого отека, которые исчезали
через 2-3 ч после процедуры. Положительный эффект начинал проявляться
через 6-8 ч после процедуры, что выражалось в увеличении тургора
и эластичности кожи, улучшении ее кровоснабжения. Отмечен положительный
эффект, заключавшийся в исчезновении мелких и уменьшении крупных
морщин. На фотографиях показан эффект пересадки через 3 месяца после
процедуры.
Сохранение положительного эффекта к настоящему времени
прослежено на протяжении 12 месяцев.
III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Как упоминалось ранее, применение культур клеток для
омоложения кожи в косметологии началось сравнительно недавно, с
использованием как аллогенных, т.е чужеродных для организма, [6],
так и аутогенных (собственных) фибробластов [7].
Полученные нами результаты говорят об эффективности применения собственных
клеток для улучшения состояния кожи взрослых пациентов, что согласуется
с мировым опытом.
В работе Келлера с соавт. [7] пациентам в возрасте 37-61 год вводили
аутогенные фибробласты кожи. Значительный и стойкий клинический
эффект наблюдался у пациентов при коррекции носогубных складок,
а также у пациентов с рубцами. Американская компания "ISOLAGEN"
провела несколько тысяч пересадок собственных клеток пациентам и
проследила сохранение положительного эффекта на состояние кожи пациентов
до 7 лет после пересадки.
Возможное объяснение этого феномена состоит в том, что при культивировании
аутогенных фибробластов in vitro происходит их реактивация или "омоложение",
то есть возврат в состояние, более близкое природе мезенхимальных
стволовых клеток. Первичная культура, полученная после трипсинизации
биопсийного материала, содержит как "молодые", так и "старые"
клетки. Все эти клетки помещаются в среду, содержащую эмбриональную
сыворотку, то есть в условия, в какой-то степени аналогичные существующим
в эмбриональном состоянии. При этом происходит стимуляция пролиферации
"молодых" клеток, сохранивших высокие способности к росту,
и разбавление или вымывание из культуры "старых" клеток,
которые потеряли способность к пролиферации. Таким образом, культура
пролиферативно омолаживается.
При обратной пересадке в кожу пациента такая реактивированная культура
клеток, очевидно, будет активно заселять дерму и усиленно синтезировать
весь комплекс компонентов внеклеточного матрикса и факторов роста,
необходимый для поддержания кожи пациента в оптимальном физиологическом
состоянии. В пользу этого свидетельствуют, например, данные Freedland
с соавт., что пролиферативный ответ культивируемых фибробластов
на стимуляцию цитокинами и синтез коллагена и неколлагеновых белков
после стимуляции трансформирующим фактором роста бета не зависели
от возраста донора клеток [8].
Важно отметить еще раз, что мы используем собственные клетки пациента,
которые не рассасываются в отличие от пересаженных аллогенных клеток,
и обеспечивают длительный эффект.
Взаимоотношения фибробластов и стволовых клеток
В заключение еще раз несколько слов о взаимоотношении
фибробластов и стволовых клеток, которым уделяется столько внимания
в последнее время. Это исходно разные понятия, потому что стволовые
клетки не имеют феномена старения при культивировании. Хотя связь
между фибробластами и мезенхимальными стволовыми клетками была подтверждена
многими исследователями, однако имелось мнение, что фибробласты
при культивировании утрачивают способность к дифференцировке в другие
типы клеток. В исследованиях последних лет это утверждение подвергается
сомнению. Так было показано, что фибробласты потенциально могут
приобретать свойства клеток скелетной мускулатуры, если трансплантируются
в регенерирующую скелетную мышцу [9]. Количество публикаций, посвященных
высокой пластичности культивируемых фибробластов, быстро увеличивается.
Все эти данные, а также положительный эффект применения препаратов
фибробластов у пациентов указывает на высокий восстановительный
потенциал аутогенных фибробластов для коррекции возрастных изменений
кожи. Дальнейшие исследования должны быть направлены на оптимизацию
схемы терапии, дозы вводимых фибробластов и наблюдение в динамике
для установления отдаленных результатов.
IV. ВЫВОДЫ
1. Отработан метод получения препаратов фибробластов
из кожи человека, пригодный для применения в косметологии.
2. Показано сохранение высокой способности к пролиферации фибробластов,
полученных от взрослых доноров.
3. Проведены испытания по применения полученных препаратов для коррекции
возрастных изменений кожи, показавшие значительный и стойкий положительный
результат.
4. Полученные данные указывают на высокую перспективность применения
культуры аутогенных фибробластов в терапевтической косметологии.
Литература
1. Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova
AI, Frolova GP . Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor
cells for octeogenic and hematopoeietic tissue. Transplantation
1968;6:230-247.
2. Степанова ЛГ, Алексеев СБ, Згурский АА, Ломанова ГА, Шалунова
НВ. Получение и характеристика нового штамма диплоидных клеток из
эмбриональной ткани легкого человека. Цитология 1986;28(12):1373-1376.
3. Hayflick L, Moorhead PS. Exp Cell Res 1961;25:585-621.
4. Cristofalo VJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1998Sept1;95(18):10614-10619.
5. Терехов СМ. Усовершенствованный метод клонирования диплоидных
фибробластов человека. Цитология 1981;23(6):717-718.
6. Алексеев АА, Попов СВ. Комбустиология 1999;1.
7. Келлер Г, Себастиан Дж, Лакомбе Ю, Тофт К, Ласк Г, Ревазова Е.
Сохранность инъецируемых аутологичных человеческих фибробластов.
Бюл эксп биол мед 2000;130(8):203-206.
8. Freedland M et al. Ann Plast Surg 1995;35(3):290-296.
9. Salvatori G, Lattanzi L, Coletta M et al. J Cell Sci 1995;108:2733-2739.
10. Методические указания РД 42-28-10-89. Минздрав СССР, Москва
1989.
|
